コロナワクチンに使用されている脂質ナノ粒子（LNP）には毒性がある

Results 研究成果

LNPの皮内および筋肉内接種により、強固な炎症が誘発された

LNPと組み合わせたmRNAは、多くの前臨床試験で使用され、最近のPfizer/BioNTechおよびModerna SARS-CoV-2ワクチンの主要成分である（Alamehら、2020年；Jacksonら、2020年；Sahinら、2020年；Walshら、2020年）。このmRNA-LNPプラットフォームの作用機序は、よく定義されていない。mRNA成分は、自然免疫センサーの関与を減少させるように改変されているが（Karikóら、2005；Karikóら、2008）、LNPと複合化したmRNAは、アジュバント活性を有することが示された（Pardiら、2018a）。mRNA-LNPプラットフォームは強固な体液性免疫応答を促進し、ワクチンを投与されたヒトはしばしば痛み、腫れ、発熱などの典型的な炎症の急性副作用を呈した（Jackson et al.、2020年）。これらの観察に基づき、mRNA-LNPアジュバント活性およびヒトで報告された副作用は、LNPの炎症特性に由来し得るという仮説を立てた。 LNPと複合化したmRNAは、3〜30μg／マウスの範囲の用量で前臨床試験に使用した（Laczkó et al, 2020; Pardi et al, 2018a）。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）または対照PBSに配合したこれらの空のLNPを10μg（4スポット；2.5μg/スポット）、成体の野生型（WT）C57BL/6（B6）マウスに皮内注入した。注入後の異なる時点でマウスを犠牲にし、注入部位から約1cm2の皮膚サンプルを採取した。LNPを注入した皮膚サンプルは、巨視的に、赤みや腫れなどの強い炎症の徴候を示した（図1A）。これらのサンプルから単細胞懸濁液を調製し、フローサイトメトリーを用いて浸潤の有無を分析した（図1BおよびS1A）。フローサイトメトリーにより、好中球が支配する大規模かつ急速な白血球の浸潤が明らかになり、14日目までにゆっくりと消失した（図1B）。LNPからイオン化可能な脂質成分を除去すると、目に見える皮膚の炎症（図1C）と白血球の浸潤（図1D）は消失した。このように、前臨床試験で使用されるLNPは、注射部位で迅速な炎症反応を促進するが、これはイオン化可能な脂質成分に依存することが判明した。


このmRNA-LNPプラットフォームを用いた前臨床動物ワクチン研究は、筋肉内および皮内接種によって実施された。両方の送達経路は、堅牢な体液性免疫応答を導いた（Laczkóら、2020；Pardiら、2018a）。現在のmRNA-LNPベースのヒトSARS-CoV-2ワクチンは筋肉内に送達され、これは臨床的実用性によって動機付けられるかもしれない（Olsら、2020年）。筋肉内送達も炎症を引き起こすかどうかを調べるために、30μLのPBSまたはPBS単独中の10μgのLNPを動物に筋肉内注射した。24時間後、注入した筋肉を分析のために採取した。皮膚と同様に、LNPを受けた筋肉サンプルに強固な好中球の浸潤が観察された（図1EおよびS1B）。LNPを注入された筋肉はまた、重量の有意な増加を示した（図1F）。したがって、これらの所見は、報告された局所的な副作用のいくつかを説明し得る大規模な局所的炎症をまとめて示している。

LNPの注入によって引き起こされるグローバルな変化についてより深く理解するために、我々は、コントロールの非コード化ポリシトシンmRNAと複合化したLNPを用いて、上に示した皮内実験を繰り返した。注入後1日目に採取した皮膚サンプルを2つに分け、LuminexとバルクRNA-seqを用いて解析した（図2A）。Luminexのデータはフローサイトメトリーの所見を裏付け、コントロールサンプルと比較して、様々な炎症性サイトカインとケモカインの存在を実証した（図2B、2C、S2）。CCL2、CCL3、CCL4、CCL7、CCL12、CXCL1、CXCL2などの好中球や単球を引きつけ、その機能を促進するケモカインがパネルを支配していた（図2B）。さらに、炎症反応のシグネチャーサイトカインであるインターロイキン-1β（IL-1β）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、IL-6が大量に検出された（図2C）。RNA-seq解析により、何千もの遺伝子がLNP注入により発現上昇することが明らかになった（図2D）。p < 0.05およびFDR < 0.05で、それぞれ9,508遺伝子および8,883遺伝子が差次的に発現していた。さらに重要なことは、フローサイトメトリーとLuminexのデータを確認すると、単球/顆粒球の発生、動員、および機能（Cxcl1、Cxcl2、Cxcl5、Cxcl10、Ccl2、Ccl3、Ccl4、Ccl7、Ccl12、Csf2およびCsf3）と炎症（IL1bおよびIL6）に関する遺伝子が対照試料に対して最も高い倍率の増加を示している点である（図2E）。また、Il1bやNlrp3など、インフラマソームの活性化に関連する遺伝子転写物の有意な上昇と、インフラマソームを抑制することが知られているNlrp10のダウンレギュレーションが観察された（図2E）。遺伝子セット濃縮分析（GSEA）は、ウイルス感染、RIG-I、NOD様、Toll様受容体シグナルを含むがこれらに限定されない多くの異なる炎症経路の活性化を示した（図2F）。プロアポトーシスおよびネクロプトシス遺伝子セットもまた、インターフェロンシグナル伝達と同様に、有意にアップレギュレートされていた（図2F）。
つまり、LNPは単独で、あるいは制御用ノンコーディングポリシトシンmRNAと複合して、マウスに強い炎症を起こすことが明らかになった。

LNPの鼻腔内接種により、肺で強固な炎症反応が起こる

SARS-CoV-2を含む呼吸器感染症は、支配的な粘膜保護抗体反応と局所T細胞媒介免疫を誘導する（Grau-Expósitoら、2021; Russellら、2020; Sterlinら、2021)。したがって、自然感染を模倣し、気道のレベルでSARS-CoV-2に対するより多くの保護を与える可能性のある免疫応答を達成するために（LundおよびRandall、2021；Russellら、2020；Zensら、2019）、研究者は、経鼻投与され得るSARS-CoV-2ワクチンの開発に活発に取り組んでいる（Buschmannら、2021；Chavdaら、2021；van Doremalenら、2021）。そこで、まず、LNPが鼻腔内投与により肺に到達するかどうかを試験した。この目的のために、我々はマウスにPBSまたは10μgのDiI標識LNPを鼻腔内に接種した。6時間後の組織検査では、肺組織にLNPが均質に分布していることが確認された（図3A）。次に、鼻腔内投与が肺の炎症を引き起こすかどうかを検証した。このために、成体WT B6マウスにPBSまたは10μgのLNPをPBS/マウスで鼻腔内接種した。接種後9時間および24時間の巨視的分析、接種後9時間のフローサイトメトリーのために、PBSおよび10μgのLNPで処理したマウスの肺のサンプルを準備した。時間のうちに、LNP接種群では肺が赤色に変色した（図3B）。皮膚と筋肉で観察されたように、フローサイトメトリー分析では、好中球と好酸球が支配する著しい白血球浸潤と、マクロファージと特定の樹状細胞（DC）サブセットの減少が認められた（図3CとS3）。このように、LNPの鼻腔内投与は、肺に大規模な炎症を引き起こす。
先に紹介した実験では、LNPを接種したマウスの死亡率が高いことが確認された。そこで、粘膜ワクチンとして安全に使用できるLNPの量を決定するために、用量反応実験を行った。成熟したWT B6マウスに2.5μgから10μg/マウスのLNPを経皮的に接種し、8日間健康状態や体重を観察した。その結果、10μgのLNPを投与したマウスの約80％が24時間以内に死亡したことが分かった（図3D）。5μgの用量は、その時間までにマウスの約20％を死亡させたが、一方、2.5μgで処理したマウスはすべて生存し、体重減少（図3D）および苦痛の有意な臨床徴候を示さなかった（図3E）。5μgおよび10μg投与では、生存したマウスは、震え／震えなどの苦痛の顕著な臨床スコアを示し、投与開始後2日間、著しく体重が減少した（図3Eおよび図3F）。最初の約3日間が経過すると、これらのマウスはもはや顕著な臨床的スコアを示し続けることはなく、体重はゆっくりと正常化し始めた（図3E）。これらのデータは、LNP用量の慎重な最適化により、mRNA-LNPプラットフォームの鼻腔内ワクチン接種への利用が可能になる可能性を示唆している。